Evaluación de la recombinasa reca sobre la unión espermatozoide-ADN exógeno en la transgénesis mediada por espermatozoides en la especie porcina

Resumen

La transgénesis mediada por espermatozoides (SMGT) es un método de producción de animales transgénicos. Se basa en la capacidad que presentan los espermatozoides de unir ADN exógeno y transferir el transgénicos a los ovocitos. Por otro lado, la proteína recombinasa de origen bacteriano RecA protege las cadenas simples de ADN de la degradación, al crear una capa protectora. Este hecho da lugar a una mayor producción de embriones viables e integración del transgén en animales producidos mediante microinyección pronuclear e ICSI. El objetivo de este estudio fue investigar la capacidad de transferencia de los complejos RecA:ssADN en espermatozoides de cerdo, así como la viabilidad de los mismos mediante citometría de fl ujo. En primer lugar, se recolectó el semen y se centrifugó para eliminar el plasma seminal. Se utilizó el plásmido EGFP que fue incubado con los espermatozoides a 16º C (grupo control). Para el grupo RecA, en primer lugar se desnaturalizó el ADN (95ºC, 5 min) y seguidamente, se incubó con la proteína RecA en hielo durante 1h, transcurrido este tiempo estos complejos (RecA:ssADN) formados se incubaron con los espermatozoides a 16ºC. La incubación en presencia de la recombinasa RecA supuso un aumento signifi cativo del porcentaje de células unidas al ADN con respecto a espermatozoides intactos incubados únicamente con el gen EGFP (Control: 19.68±0.73% vs. RecA: 24.69±0.70%; p<0.01). Los resultados mostraron que para ambos grupos la unión se produce principalmente a células no viables (Control: 19.21±0.71% vs. RecA: 24.11±0.69%; p<0.01), y en una muy baja relación a espermatozoides viables (Control: 0.47±0.09% vs. RecA: 0.58±0.09%; p=0.40). Con este estudio hemos demostrado que los complejos RecA:ssADN interaccionan con los espermatozoides porcinos en mayor proporción que para el caso de los espermatozoides únicamente incubados con el transgén, y para ambos casos esta asociación se produce principalmente a células no viables. Por lo tanto se podría utilizar la SMGT combinada con técnicas de reproducción asistida como la ICSI para la obtención de embriones y lechones transgénicos.